A hidrogenázok és a kénanyagcsere kapcsolatának jellemzése fototróf bíbor kénbaktériumokban

Előnézet	PDF (disszertáció) Download (1MB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (190kB) | Előnézet
Előnézet	PDF (tézisfüzet) Download (221kB) | Előnézet

Magyar nyelvű absztrakt

Napjaink egyik legfontosabb feladata a megújuló energiaforrásokból származó környezetbarát energiahordozókra való áttérés. Ezen kihívásnak felelhet meg a biohidrogén, ami előállítható foto- és sötétfermentációval hidrogenáz vagy nitrogenáz enzimek segítségével. A nitrogenáz alapú hidrogéntermelés nagy előnye, hogy a hidrogén részéről termékgátlás nem alakul ki. A legideálisabb megoldás azonban a hidrogén fotoautotróf körülmények közti előállítása. Jelenleg tudományos szempontból a legnépszerűbb megközelítés a kétlépéses alga alapú hidrogéntermelés, aminek hátránya, hogy az intenzív hidrogéntermeléshez acetátot is igényel a mikroba, illetve hosszútávon fenntartható módszer még nem ismeretes. A fototróf bíbor kénbaktériumok nevüket onnan kapták, hogy anaerob fotoszintézisükhöz elektrondonorként leginkább kénvegyületeket használnak. A tioszulfát asszimilációja és a kén oxidációja során felszabaduló elektronokat megvilágítás hatására a fotoszintetikus reakciócentrumba adják, ahol azok energiát nyerve az RC Qb helyén keresztül a kinon raktárba kerülnek. Ezzel szemben a szulfit oxidációja közvetlenül a kinon raktárba juttatja az elektronokat. Innen protonmotoros erő felhasználásával NAD+ redukcióra fordítódhatnak vagy citokróm bc1 komplex segítségével periplazmatikus citokrómokat redukálnak, miközben protongrádiens képzés történik. Thiocapsa roseopersicina BBS-ben négy aktív [NiFe]-hidrogenáz van, ezek közül kettő membrán asszociált: a Hyn és a kizárólag hidrogén felvételi irányban működő Hup. A másik kettő citoplazmatikus NAD+ redukáló enzim: a Hox1 és a Hox2. Ezen kívül modellorganizmusunk képes a hidrogéntermelésre nitrogenáz enzime segítségével is. Munkám során az volt a célom, hogy megvizsgáljam a fotoszintetikus elektrontranszportlánc elemei és a Hyn és Hox1 hidrogenázok közti kapcsolatot, részletes modellt állítsak föl a kapott eredmények alapján. A Hyn hidrogenáz egy figyelemreméltó stabilitással rendelkező kétirányú hidrogenáz, aminek van két elektrontranszfer alegysége, a transzmembrán Isp1 és membrán asszociált citoplazmatikus orientációjú Isp2. A Hyn hidrogenáz hidrogéntermelése kizárólag elemi kén és tioszulfát jelenlétében valósul meg. HynL-specifikus Western analízis segítségével kimutattam, hogy a GB2131 és THOE5M törzsek közti hidrogéntermelésbeli különbségért a sejtekben található eltérő mennyiségű hidrogenáz felel, míg a tápoldat tioszulfát tartalmának függvényében a törzsek hidrogenáztartalma nem változott. Ez alapján a két kénvegyület a megnövelt elektronfluxuson keresztül képes a hidrogéntermelés növelésére. A tioszulfát asszimiláció és a kénoxidáció a fotoszintetikus reakciócentrum akceptor oldalára juttatják az elektronjaikat, így megvilágítás alatt képesek redukáló erőt biztosítani a Hyn hidrogéntermeléséhez. Ezzel szemben a szulfit oxidáció, mely a kinon raktárral áll kapcsolatban, nem képes elektronokat biztosítani a Hyn számára. A két hidrogéntermelést serkentő útvonal közül úgy tűnik, hogy - a Hyn esetén - a tioszulfát asszimiláció a jobb elektrondonor. A Hyn hidrogenáz hidrogéntermelése fényfüggő, a Hyn elektrondonora a fotoszintetikus elektrontranszport lánccal áll kétirányú kapcsolatban. Ezt a Hyn és hidrogénfüggő kénhidrogén termelés terbutrinnal történő gátlásával erősítettem meg. A fotoszintetikus elektrontranszport láncnak van egy másik szerepe is a Hyn hidrogéntermelésében. Ez a protongrádiens előállítása, aminek CCCP-vel való eliminálása esetén csökken, de nem szűnik meg a Hyn hidrogéntermelése. Leolvasási keret elrontása nélküli mutagenezissel elkészítettem a Hyn Isp2 alegységét nem tartalmazó törzset. Ennek hiányában megszűnt a hidrogéntermelés és a hidrogénfüggő kénhidrogén termelés egyaránt, tehát az Isp2 része a Hyn elektrontranszport láncának. Különböző elektronakceptor jelöltek vizsgálata során azt az eredményt kaptuk, hogy nemcsak az elemi kén képes a Hyn függő hidrogénfelvétel gyorsítására, hanem a nitrát is. Kijelenthetjük, hogy a Hyn nem specifikusan a kénanyagcseréhez, hanem a membrán elektrontranszport lánchoz kötött, és olyan elektronakceptorok redukciójára képes, amik közvetve vagy közvetlenül a kinon raktárból nyernek elektronokat, így a Hyn működése a kinon raktár redox állapotának függvénye. A Hox1 hidrogenáz egy heteropentamer szerkezetű hidrogenáz, melynek hidrogéntermelése fotoszintetikus körülmények között elemi kén oxidációhoz illetve a kinonokat redukáló szulfitoxidációhoz kapcsoltan megy végbe. Ez teljesen összhangban van a rendelkezésünkre álló irodalmi adatokkal, miszerint a Hox1 hidrogéntermelése kapcsolható a NADH-hoz, a NAD+ redukciója pedig a kinon raktárhoz kötött és protonmotoros erőt használ fel, amit a fotoszintetikus ciklikus elektrontranszport állít elő (Madigan és Martinko, 2009). A kinon raktárhoz való kapcsoltságát alátámasztja az is, hogy a Hox1 hidrogéntermelése és a kénhidrogén termelés kompetitív folyamatok, ami alapján a membránredox rendszer túlredukciója elleni védelem lehet a Hox1 feladata.

Tétel nézet