Szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára alkalmas módszerek kidolgozása Escherichia coliban

	PDF (disszertáció) Download (5MB)
	PDF (tézisfüzet) Download (940kB)

Magyar nyelvű absztrakt

Kidolgoztunk egy egyszerű módszert, amellyel a szekvencaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálható in vivo, Escherichia coliban. Az I-Block-nak nevezett módszer a laktóz-operon jól ismert szabályozási mechanizmusán alapszik. A módszer három alapvető eleme a lacI deléciós E.coli törzs ER1821 ΔlacI, az E. coli lacI gént hordozó pLacI plazmid, valamint az azzal kompatibilis pDBP plazmid, amely a vizsgált fehérje génjét kódolja. A vizsgált fehérje potenciális kötőhelyét a pLacI plazmid lacI promoterébe klónoztuk. Ha a vizsgált fehérje kötődik a célhelyhez, a konstitutív lacI transzkripció gátlódik, ami indukálja a genomban kódolt β-galaktozidáz termelődését. A specifikus DNS-fehérje kölcsönhatás így egyszerűen, a β-galaktozidáz aktivitás mérésével kimutatható. Az I-Block módszer működését 5 DNS-kötő fehérjével (két mesterségesen előállított cink-ujj fehérjével, a természetes ’helix-turn-helix’ DNS-felismerő doménnel rendelkező cI857 lambda fág represszorral és a Tet represszorral, valamint a CRISPR-dCas9 fehérjével) demonstráltuk. Az 5 fehérje 3 különböző DNS-felismerő fehérje-családba tartozik, ez azt jelzi, hogy a módszer várhatóan a DNS-kötő fehérjék széles körénél alkalmazható lesz. A módszer megfelelő működéséhez a Lac represszor alacsony szintű konstitutív termelésére van szükség, melyet egy kis kópiaszámú plazmidvektor használatával értünk el. Annak érdekében, hogy megtaláljuk a tesztszekvencia beépítésének a módszer működése szempontjából legjobb helyét, a lacI promoter 3 különböző pontján pontmutációval restrikciós klónozóhelyeket hoztunk létre. A legalkalmasabbnak a -10-es elemmel átfedő NheI hely bizonyult, amelyhez valószínűleg az is hozzájárult, hogy az NheI helyet létrehozó pontmutáció gyengítette a lacI promotert (lacIN promoter). A módszer működésének fontos feltétele, hogy a lacI promoterbe beépített szekvencia önmagában ne gátolja a lacI transzkripciót. A nagyon eltérő guanin- ill. citozintartalmú szálakkal rendelkező cink-ujj felismerőhelyekkel való munka során figyeltünk fel arra, hogy a nem-templát szálon a citozinban gazdag célszekvenciák gátolják a lacI transzkripciót. A módszer korábbi változatában a célszekvenciákat a -10-es promoter-elemmel átfedő NheI helybe, vagy az NheI és a tőle 3’ irányban lévő EcoRI hely közé építettük be. Újabb eredményeink azt mutatták, hogy a -10-es elemtől a a transzkripciós kezdőhelyig (+1) terjedő szakaszon célszerű meghagyni az eredeti szekvenciát. Ez azzal az előnnyel jár, hogy a transzkripció intenzitására hatással bíró diszkriminátor szekvencia és a transzkripciós kezdőhely a beépített célszekvenciáktól függetlenül mindig ugyanaz marad. Az I-Block módszer eredeti változatában csak kis számú fehérje – DNS kombináció vizsgálatára alkalmas. Továbbfejlesztettük a módszert egy „nagy áteresztőképességű” technika irányába azzal a céllal, hogy alkalmas legyen DNS-kötő fehérjék kötőhelyének egy komplex oligonukleotid-könyvtárból való azonosíthatására. Egy 18 bp hosszú randomizált szekvenciát, mint célhelyeket tartalmazó pLacI könyvtárból kapott transzformánsok között magas volt a LacI- klónok száma, ezek az álpozitív klónok zavarják a módszert. Összhangban korábbi, egyedi célszekvenciákkal tett megfigyelésünkkel, az Illumina szekvenálás azt mutatta, hogy a randomizált szekvenciákkal kapott LacI- klónok jelentős részében a beépített szekvencia nem-templát szála citozinban gazdag. A jelenségnek az inszertszekvencia citozintartalmától való függését az is alátámasztotta, hogy ha a random szekvencia kémiai szintézisekor a nukleotidarányt úgy módosítottuk, hogy ¼ helyett csak 1/10 arányban tartalmazzon citidint - az álpozitív, LacI- β-gal+ sejtek aránya a felére csökkent. A σ32 faktor függő promoterrel kapott eredményeink azt sugallják, hogy az egyes inszertszekvenciák következtében megjelenő LacI- fenotípus hátterében egy ismert jelenség, a transzkripció iniciációs fázisából az elongációba való átmenet megakadása áll. Ilyenkor az RNS polimeráz σ70 alegysége a kezdeti átírt szekvenciához tartósan kötődik, ezáltal megakadályozza vagy lelassítja az elongációba való átmenetet. Azonban a lacI transzkripciót olyan σ70 mutánsokkal, melyekről ismert, hogy toleránsabbak az elakadást kiváltó szekvenciákkal szemben, nem sikerült helyreállítani. A beépítés helyének 3’ irányba való tolásával megemelkedett a LacI koncentráció, azonban a transzkripciós kezdőhelytől távol (+10) beépített szekvenciával már nem volt hatékony a specifikus kötés kimutatása, mivel a tesztfehérje kötődése nem represszálta a lacI transzkripciót. A lacI transzkripció gátlását okozó szekvenciák számát sikerült azzal csökkenteni, és ezáltal az I-Block módszerrel vizsgálható szekvenciák számát növelni, hogy a lacIN promotert az erősebb, vad típusú lacI promoterre cseréltük. Kidolgoztunk egy rendszert a LacI+ sejtek szelektálásához. A lacI gént transzkripciós kapcsoltságba hoztuk az ampicillin rezisztenciát biztosító β-laktamáz génnel. Ez a bicisztronos konstrukció lehetővé teszi, hogy a LacI- s

Absztrakt (kivonat) idegen nyelven

We have developed a simple method (I-Block) for studying sequence specific DNA-protein interactions in vivo, in Escherichia coli. The technique is largely based on the well-known regulatory mechanism of the lac operon and has three essential constituents: the E. coli ER1821 ΔlacI lacI deletion strain, and two compatible plasmids. The pLacI plasmid carries the E. coli lacI gene and the pDBP plasmid encodes the gene of the tested protein. The potential binding site of the investigated protein is inserted into the lacI promoter on the pLacI plasmid. If the protein of interest binds to the target site, the constitutive lacI transcription is blocked, and the synthesis of β-galactosidase is induced. Thus, specific DNA-protein interaction can be detected by measuring β-galactosidase activity. We demonstrated functioning of the I-Block assay using five DNA binding proteins: two custom-made zinc finger proteins, two proteins utilizing helix-turn-helix domain for DNA recognition (the lambda phage cI857 repressor and the Tet repressor) and the CRISPR-dCas9 protein. Because these proteins belong to three different classes of DNA recognizing proteins, we assume that the technique can be used for a wide range of DNA binding proteins. For proper functioning of the method, low constitutive production of Lac repressor is needed, which was achieved with the use of a low copy number plasmid vector. To find the insertion site that is optimal for the assay, three restriction sites were created within the lacI promoter by site-directed mutagenesis. Of the three cloning sites, the NheI site overlapping the -10 conserved element proved best, partly because it weakened the strength of the promoter (the lacIN promoter). An important precondition of the method is that the inserted target sequence should not impair transcription of the lacI gene. The zinc-finger recognition sites have highly unequal distribution of guanines and cytosines in the two strands. We observed that the cytosine-rich sequences in the non-template strand block lacI transcription. In the earlier version of the assay, the target sites were inserted into the NheI site, or between the NheI site and the EcoRI site located downstream of the NheI site. More recent results showed that consistency of the assay is improved if the sequence between the -10 conserved element and the transcriptional initiation site (+1) is left intact. Inserting the foreign sequence at the +2 transcriptional position has the advantage that the discriminator sequence and the transcriptional start site, which have an effect on the rate of transcription, remain the same independently of the inserted target sequence. The I-Block assay can, in its original version, test only a small number of DNA-protein combinations. With the goal to make the technique capable of finding the target site of a DNA binding protein within a complex oligonucleotide library, we developed the method in the direction of a „high-throughput” technique. We have cloned an 18 bp random sequence as target site into pLacI. The transformants obtained with the plasmids contained a high proportion of LacI- clones, which disturb the assay. Consistently with our previous observations made with individual sequences, Illumina sequencing showed that in a substantial number of LacI- clones, the non-template strand of the inserted sequence was rich in cytosines. Dependence of the phenomenon on the cytosine content of the inserted target sites was also supported by the results of the experiment, in which during the chemical synthesis the molar ratio of cytosines was decreased from 0.25 to 0.1. The proportion of LacI- clones obtained from this library decreased by half. Results with σ32 –dependent promoter suggest that the appearance of LacI- phenotype in the case of certain inserted sequences is caused by a known phenomenon, the blockage of transition from transcriptional initiation to elongation. In such cases the σ70 subunit of RNA polymerase stays bound to the initial transcribed sequence and blocks or slows down the transition to elongation. Transcription of the lacI gene was not restored by σ70 mutants, which are known to be more tolerant towards sequences blocking the transition. Transcriptional blockage by the inserted foreign sequence could be abolished by moving the insertion site in the 3’ direction, but position +10 was already too far, because binding of the protein at this position did not block the lacI transcription. It was possible to decrease the number of blocking sequences thus increase the searchable sequence space by replacing the lacIN with the stronger wild-type lacI promoter. We have developed a system for the selection of LacI+ clones. The lacI and the β-lactamase genes were cloned in a tandem arrangement to ensure coupled transcription. Transcriptional coupling allows elimination of LacI- clones by selecting for ampicillin resistance. The gene of chloramphenicol-acetyltransferase was fused to

Tétel nézet